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細胞適應干細胞無血清培養(yǎng)基的方法

更新時間:2019-01-16 點擊次數(shù):1139
眾所皆知干細胞無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養(yǎng)時,多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時,由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白,細胞往往以懸浮形式生長。
1.直接適應——細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到干細胞無血清培養(yǎng)基(SFM)中。
一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應干細胞無血清培養(yǎng)基。對于直接適應,接種細胞密度應該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時,傳代培養(yǎng)細胞。當細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時,細胞*適應了干細胞無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天,當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了干細胞無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。
2.連續(xù)適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到干細胞無血清培養(yǎng)基(SFM)中,與直接適應相比較,連續(xù)適應趨向?qū)τ诩毎訙睾鸵恍?/div>
(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。
(2)當細胞密度>5×10細胞/ml時,以2×10到3×10細胞/ml細胞密度,在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
(3)以2×10到3×10細胞/ml細胞密度,25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。
(4)當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml(接種后4到6天),在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
(5)每隔3到5天,當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了干細胞無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。
建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,直到每一次細胞適應了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。
在適應過程中,不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養(yǎng)基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),因而更易于受外界因素的影響。
細胞培養(yǎng)適應替代血清:許多細胞利用連續(xù)適應方法能很好的適應,用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式,連續(xù)幾代減少當前培養(yǎng)基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應改變血清比例時,傳代細胞2到3次。
培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長的延遲可能會發(fā)生,4允許進行2到3次的傳代,使生長率恢復到以前的水平。
特別需要強調(diào)的是:配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為干細胞無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微,也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

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